ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ

Одно из крупнейших, достижений прикладной физики XX века— это создание электронного микроскопа; оно привело к перевороту в наших представлениях о биологических структурах. Электронная микроскопия основана на том, что электромагнитное поле влияет на пучок электронов аналогично тому, как стеклянная линза действует на луч света.

Электронный луч обладает свойствами электромагнитного излучения с очень малой длиной волны. Если электроны ускорены в электрическом поле напряжением 100 кВ, то длина такой волны составляет всего лишь 0,04 нм, т. е. примерно в 10 000 раз меньше, чем у видимого света.

Соответственно и предельное разрешение электронного микроскопа на несколько порядков выше, чем у светового [см. уравнение (2.1)], и с его помощью можно достичь гораздо большего эффективного увеличения. Как показано на рис. 2.9, путь электронов в трансмиссионном электронном микроскопе аналогичен пути света в световом микроскопе

Выходящий из электронной пушки пучок электронов проходит через ряд электромагнитных линз. Конденсорная линза коллимирует электронный пучок на препарате, а несколько увеличивающих линз создают увеличенное изображение.

Будучи спроецировано на флуоресцирующий экран (аналогичный экрану телевизора), оно становится видимым. Поскольку воздух препятствовал бы движению электронов, весь путь электронного пучка должен находиться в высоком вакууме; поэтому изучаемый объект должен быть предварительно полностью высушен.

Так как электроны обладают низкой проникающей способностью, в электронном микроскопе можно исследовать лишь очень тонкие срезы толщиной не более 100 нм.

В трансмиссионном электронном микроскопе контраст обусловлен тем, что электроны по-разному рассеиваются на различных участках препарата, причем эффективность их рассеяния зависит от числа и массы атомов, находящихся на пути пучка.

Так как в состав биологических материалов входят в основном атомы с небольшой массой, контрастность таких материалов невысока.

Однако ее можно значительно повысить, «окрашивая» препарат солями различных тяжелых металлов (например, свинца, вольфрама или урана), которые могут быть фиксированы на самом объекте (позитивное кон-трастирование) или использованы для повышения электронной плотности окружающего поля (негативное контрастирование).

Применение негативного контраста особенно выгодно при исследовании таких мельчайших структур, как вирусные частицы, белковые молекулы или жгутики бактерий (см. рис. 12.3). Однако клетки даже очень мелких микроорганизмов имеют слишком большую толщину, чтобы их можно было целиком наблюдать в электронный микроскоп.

Для того чтобы выявить внутреннюю тонкую структуру клеток, их фиксируют, обезвоживают, заключают в пластик и делают срезы. Затем такие ультратонкие срезы (толщиной не более 50 нм) контрастируют солями тяжелых металлов и уже после этого наносят на подложку.

При исследовании биологических объектов в трансмиссионном электронном микроскопе часто применяют два других метода приготовления препаратов: напыление металлом и «замораживание — травление» (freeze-etching). При напылении металлом на высушенный препарат под острым углом направляют поток ионов тяжелого металла (платины, палладия или золота) и в результате получают изображение, которое выявляет трехмерную структуру объекта.

При замораживании— травлении объект замораживают и замороженный блок расщепляют ножом микротома, в результате чего обнажаются различные поверхности, имеющиеся у объекта и внутри него. Поверхность излома напыляют тяжелым металлом под острым углом, а уже на металл напыляют углеродную пленку подложки.

Затем специальной химической обработкой объект разрушают и исследуют под микроскопом его отпечаток. Метод замораживания — травления особенно полезен при изучении структуры клеточных стенок и мембран.